————滕勇，乔治亚医学院助理研究员
或许大家已认同在裸鼠体内建立人类肿瘤生成和转移模型，但不可否认该模型花费太高，周期太长，实验重复性和一致性较差。实际上模式生物斑马鱼同样可作为肿瘤生长和转移的理想模型，不仅可以减少金钱和时间上的投入，还可以从生物整体水平上观察到肿瘤腺细胞生长和转移的动态变化过程。要想在斑马鱼体内建立好这个模型，除了具备熟练的显微操作等技术外，还不可小觑以下几个小提醒：
1. 注射50-300个人类肿瘤细胞到胚胎发育48小时的斑马鱼体内，细胞过少，无法建立肿瘤模型，细胞过多导致斑马鱼发育畸形和致死；
2. 肿瘤细胞应注射在斑马鱼的perivitelline cavity(如下图所示)，如注射到其他部位往往导致细胞无法进入斑马鱼血液循环体系，失去生长和迁移的微环境；
3. 最好用CM-DiI来标记肿瘤细胞，因为这种染料可以同时标记母细胞和分裂生长的子细胞，而且染色作用可持续2周以上；
4. 已经注射肿瘤细胞的斑马鱼先在28℃的培养箱内孵化约1小时，然后转移到35℃的培养箱内，这个温度有助于斑马鱼和人类肿瘤细胞共生长。
软琼脂(soft agar)实验一般用来检测细胞的集落形成能力。现在这种方法越来越多的用于分离癌细胞，也可以用来确认癌细胞是否具有癌化特性，为进一步做肿瘤小鼠移植模型奠定理论基础。该方法看似简单，但如果细节掌握不好，往往导致实验失败或数据缺乏说服力。如果你曾经在这个实验上栽了跟头，请不妨在如下几个方面进行尝试：
1.要确保在整个实验过程中所使用的琼脂处于完全液体状态（>80℃），尤其是在做基底时，如果琼脂凝固过快会导致基底不均一；
2. 做琼脂基底是应避免产生小气泡，一旦有小气泡产生，应该立即将气泡赶走；
3. 应使用2倍浓度的培养基，并加入20%FBS 和2%的P/S；
4. 在制备上层时，混合液体需要有顺序，一般为在同一个移液管中先吸取液态琼脂，再吸取同体积的2倍浓度的培养基，最后在吸取2倍体积的细胞悬液，这样既可以保证琼脂不立即固化，又可以有效避免细胞因温度过高而烫死；
5. 因为该实验周期较长，为避免过度蒸发而导致琼脂裂解，需要保证小环境持久湿润，一般可在六孔板或培养皿下面垫上三到四层湿润的薄纸。
如果你的文章投往Impact factor比较高的杂志并涉及到mRNA表达量的变化，很多Reviewer都希望看到real-time PCR的实验结果，因为该技术不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且更具特异性，有效解决PCR污染等问题。但如何设计适用于real-time PCR的特异性引物是你必须解决的首要问题。Taqman探针技术是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针特异性更强，灵敏度更高，而且条件优化容易，但价格比较昂贵。其实如果你掌握了引物设计要领，技术更简单，价格更低廉的SYBR方法足以达到一般实验的要求。除了具备设计常规PCR引物的知识外，你现在还需要做的是：
1. 扩增长度应最好能在80-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得；
2. 目的基因扩增片段应和管家基因的扩增片段大小相仿，这样可以确保在同一扩增体系中两个基因都能获得相近的扩增效率，从而保证分析的一致性和数据的精准性；
3. 为避免基因组的扩增污染，引物设计最好能跨两个外显子；
4. 为确保引物特异性，除了将设计好的序列在blast中核实外，最好先用常规PCR进行检测，跑胶时应没有其他非特性条带和primer dimer。
1. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Rouhi P, Jensen LD, Cao Z, Hosaka K, Lanne T, Wahlberg E, Steffensen JF, Cao Y. Nat Protoc. 2010;5(12):1911-8.
这篇文章根据某一实例手把手教你如何建立斑马鱼肿瘤模型，当然请不要忘记我的Tips哦！
2. A map of human genome variation from population-scale sequencing, Nature 2010; 467(7319): 1061-73
在生命科学领域的热门论文作者中，排名第一的是哈佛麻省Broad研究院的Eric S. Lander教授。这位著名的遗传学家是Broad医学院的创始人之一，人类基因组计划领导者之一，美国科学院院士。Lander教授已经连续八年登上了这个热门作者排行榜，其中这篇发表于2010年的千人基因组计划成果论文是世界上引用数最多的生物学论文之一。
3. Knockdown of zebrafish Lgi1a results in abnormal development, brain defects and a seizure-like behavioral phenotype. Teng Y, Xie X, Walker S, Rempala G, Kozlowski DJ, Mumm JS, Cowell JK. Hum Mol Genet. 2010;19(22):4409-20.
这篇文章重点介绍了如何在斑马鱼体内建立世界上第一例基因敲除癫痫模型，以及如何运用生物统计学知识结合使用Viewpoint等专业仪器监测和分析斑马鱼的行为学变化。当然最重要的推荐原因是：偶的心血，偶的文章秀了。
1.转染质粒时如使用Qiagen的Effectene Transfection Reagent，和Lipofectamine 2000等转染试剂相比，不仅可大大减少需要转染的DNA量，降低转染试剂所产生的细胞毒性，无需在转染后换液，而且操作方便，转染前后都可以用含双抗的完全培养基培养细胞，因此可有效避免外源污染。”
2.抗体公司有很多，如果你挑的眼花缭乱，又担心高价买回来却不工作，那么在你做选择之前，请先check 一个权威网站：http://www.proteinatlas.org/. 或许意外就在眼前。
3.如果你一下子理解不了某英文参考文献，或者理解了依然无法将理论应用于现实操作中，那么不妨阅读一下生物医学领域第一个视频期刊The Journal of Visualized Experiments (JoVE)。现在你感觉到轻松了吗？ （）
（来源：生物谷）
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肿瘤学达人实验Tips分享
发布时间：2012-08-08 00:00 文章来源： 作者：
滕勇 人类疾病模型和肿瘤学达人
“或许经验并不能直接给你带来财富，但会给你创造更多的机会。 而创造机会，才是领悟生命和感受成功的最好途径。”
————滕勇，乔治亚医学院助理研究员
Tip 1. 如何在斑马鱼体内快速建立肿瘤生成和转移模型
或许大家已认同在裸鼠体内建立人类肿瘤生成和转移模型，但不可否认该模型花费太高，周期太长，实验重复性和一致性较差。实际上模式生物斑马鱼同样可作为肿瘤生长和转移的理想模型，不仅可以减少金钱和时间上的投入，还可以从生物整体水平上观察到肿瘤腺细胞生长和转移的动态变化过程。要想在斑马鱼体内建立好这个模型，除了具备熟练的显微操作等技术外，还不可小觑以下几个小提醒：
1. 注射50-300个人类肿瘤细胞到胚胎发育48小时的斑马鱼体内，细胞过少，无法建立肿瘤模型，细胞过多导致斑马鱼发育畸形和致死；
2. 肿瘤细胞应注射在斑马鱼的perivitelline cavity(如下图所示)，如注射到其他部位往往导致细胞无法进入斑马鱼血液循环体系，失去生长和迁移的微环境；
3. 最好用CM-DiI来标记肿瘤细胞，因为这种染料可以同时标记母细胞和分裂生长的子细胞，而且染色作用可持续2周以上；
4. 已经注射肿瘤细胞的斑马鱼先在28℃的培养箱内孵化约1小时，然后转移到35℃的培养箱内，这个温度有助于斑马鱼和人类肿瘤细胞共生长。
Tip 2. 如何作好软琼脂实验分析
软琼脂(soft agar)实验一般用来检测细胞的集落形成能力。现在这种方法越来越多的用于分离癌细胞，也可以用来确认癌细胞是否具有癌化特性，为进一步做肿瘤小鼠移植模型奠定理论基础。该方法看似简单，但如果细节掌握不好，往往导致实验失败或数据缺乏说服力。如果你曾经在这个实验上栽了跟头，请不妨在如下几个方面进行尝试：
1.要确保在整个实验过程中所使用的琼脂处于完全液体状态（>80℃），尤其是在做基底时，如果琼脂凝固过快会导致基底不均一；
2. 做琼脂基底是应避免产生小气泡，一旦有小气泡产生，应该立即将气泡赶走；
3. 应使用2倍浓度的培养基，并加入20%FBS 和2%的P/S；
4. 在制备上层时，混合液体需要有顺序，一般为在同一个移液管中先吸取液态琼脂，再吸取同体积的2倍浓度的培养基，最后在吸取2倍体积的细胞悬液，这样既可以保证琼脂不立即固化，又可以有效避免细胞因温度过高而烫死；
5. 因为该实验周期较长，为避免过度蒸发而导致琼脂裂解，需要保证小环境持久湿润，一般可在六孔板或培养皿下面垫上三到四层湿润的薄纸。
Tip 3. 如何设计适用于实时荧光定量PCR的特异性引物？
如果你的文章投往Impact factor比较高的杂志并涉及到mRNA表达量的变化，很多Reviewer都希望看到real-time PCR的实验结果，因为该技术不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且更具特异性，有效解决PCR污染等问题。但如何设计适用于real-time PCR的特异性引物是你必须解决的首要问题。Taqman探针技术是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针特异性更强，灵敏度更高，而且条件优化容易，但价格比较昂贵。其实如果你掌握了引物设计要领，技术更简单，价格更低廉的SYBR方法足以达到一般实验的要求。除了具备设计常规PCR引物的知识外，你现在还需要做的是：
1. 扩增长度应最好能在80-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得；
2. 目的基因扩增片段应和管家基因的扩增片段大小相仿，这样可以确保在同一扩增体系中两个基因都能获得相近的扩增效率，从而保证分析的一致性和数据的精准性；
3. 为避免基因组的扩增污染，引物设计最好能跨两个外显子；
4. 为确保引物特异性，除了将设计好的序列在blast中核实外，最好先用常规PCR进行检测，跑胶时应没有其他非特性条带和primer dimer。
文献推荐
1. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Rouhi P, Jensen LD, Cao Z, Hosaka K, Lanne T, Wahlberg E, Steffensen JF, Cao Y. Nat Protoc. 2010;5(12):1911-8.
这篇文章根据某一实例手把手教你如何建立斑马鱼肿瘤模型，当然请不要忘记我的Tips哦！
2. A map of human genome variation from population-scale sequencing, Nature 2010; 467(7319): 1061-73
在生命科学领域的热门论文作者中，排名第一的是哈佛麻省Broad研究院的Eric S. Lander教授。这位著名的遗传学家是Broad医学院的创始人之一，人类基因组计划领导者之一，美国科学院院士。Lander教授已经连续八年登上了这个热门作者排行榜，其中这篇发表于2010年的千人基因组计划成果论文是世界上引用数最多的生物学论文之一。
3. Knockdown of zebrafish Lgi1a results in abnormal development, brain defects and a seizure-like behavioral phenotype. Teng Y, Xie X, Walker S, Rempala G, Kozlowski DJ, Mumm JS, Cowell JK. Hum Mol Genet. 2010;19(22):4409-20.
这篇文章重点介绍了如何在斑马鱼体内建立世界上第一例基因敲除癫痫模型，以及如何运用生物统计学知识结合使用Viewpoint等专业仪器监测和分析斑马鱼的行为学变化。当然最重要的推荐原因是：偶的心血，偶的文章秀了。
工具推荐
1.转染质粒时如使用Qiagen的Effectene Transfection Reagent，和Lipofectamine 2000等转染试剂相比，不仅可大大减少需要转染的DNA量，降低转染试剂所产生的细胞毒性，无需在转染后换液，而且操作方便，转染前后都可以用含双抗的完全培养基培养细胞，因此可有效避免外源污染。”
2.抗体公司有很多，如果你挑的眼花缭乱，又担心高价买回来却不工作，那么在你做选择之前，请先check 一个权威网站：http://www.proteinatlas.org/. 或许意外就在眼前。
3.如果你一下子理解不了某英文参考文献，或者理解了依然无法将理论应用于现实操作中，那么不妨阅读一下生物医学领域第一个视频期刊The Journal of Visualized Experiments (JoVE)。现在你感觉到轻松了吗？
（来源：生物谷）