Medical Research

通过找到控制肿瘤进展的驱动基因，进而精确有效的“打靶”驱动基因这一策略在过去的二十年里被成功的用于绝大部分肿瘤的治疗，以总体较小的副作用，极大地提高了病人的预后和生活质量。然而靶向治疗的效果和治疗有效性的持续时间常常受限于肿瘤细胞基因组层面复杂的多样性，或称之为肿瘤异质性。近年来，肿瘤异质性的成因以及异质性对肿瘤抗药性的影响成为癌症研究的一大热点。

前列腺癌是男性最常见的肿瘤之一，而去势抵抗性前列腺癌（CRPC）是对激素疗法产生抗性的前列腺癌，五年存活率只有28%。纪念斯隆凯特琳癌症研究中心的Charles Sawyers研究组曾在2009年阐明了去势抵抗性前列腺肿瘤的存活和进展仍然依赖于雄激素受体的过度表达和激活，并由此开发了第二代雄激素受体靶向抑制剂，Enzalutamide（恩杂鲁胺）和Apalutamide（阿帕鲁胺）[1-2]。尽管第二代的雄激素受体抑制剂大大延长了病人的无进展中位生存期，但绝大部分病人最终都会产生耐药性[3-5]。另外有大约30%的病人一开始就对二代雄激素抑制剂治疗不敏感，造成晚期转移后的去势抵抗性前列腺肿瘤至今仍是不治之症[6]。因此，研究并阐明去势抵抗性前列腺癌对二代雄激素受体靶向抑制剂的抗性分子机理可能为治疗这种不治之症提供崭新的思路，为新的联合疗法提供理论支持，从而改善癌症病人的治疗效果和预后。

2020年3月26日，德克萨斯大学西南医学研究中心牟平教授团队与纪念斯隆凯特琳癌症中心Charles Sawyers团队合作在Cancer Cell杂志上在线发表了一项关于染色质结构可塑性改变并增强肿瘤异质性，从而促进前列腺癌症耐药性新机制的转化医学研究成果。

研究者首先通过生物信息学的方法比对并整合6个大规模的前列腺肿瘤的外显子测序数据库，找到了730个在前列腺癌症里特异性缺失的基因，并由此构建基于Mir-E系统的shRNA介导基因沉默文库[7]。然后利用去势抵抗性前列腺肿瘤的Xenograft小鼠作为模型，通过将该基因沉默文库转入人源前列腺肿瘤细胞，随后移植入小鼠体内进行大规模反向遗传学筛选，寻找到底是哪些基因功能缺失后能造成小鼠体内的前列腺肿瘤对于二代雄激素受体抑制剂Enzalutamide恩杂鲁胺产生耐药性。

通过对于耐药性肿瘤的深度测序，研究者发现CHD1 (染色质-DNA螺旋结合蛋白1) 缺失的肿瘤细胞在耐药性前列腺肿瘤中大量富集。研究者接着通过CRISPR-Cas9系统和shRNA系统在多个体外和体内前列腺肿瘤模型里验证了CHD1缺失可以导致严重的肿瘤抗药性。有趣的是，研究者还发现，这种由于CHD1缺失造成的抗药性不但发生的非常迅速，而且还是可逆的，并且不依赖于重新激活雄激素介导的信号系统，这和传统观点中雄激素信号的重启并不相同。

CHD1蛋白广泛的存在于细胞核中，是一个依赖水解ATP来实现DNA解旋的分子马达。它的活性往往伴随着大范围的染色质结构重塑。过往研究表明CHD1通过结合组蛋白H3K4me2/3干细胞全能化的实现中具有重要作用[8]。因此研究者提出假设CHD1极有可能造成了全局性的染色体结构重塑，进而调节细胞的谱系命运和表型特征从而造成癌症细胞不在依赖雄激素受体而存活。随后研究者对CHD1-缺失的耐药肿瘤细胞进行了RNA-seq和ATAC-seq的组合测序，并与CHD1野生型细胞进行对比后发现在CHD1缺失后的肿瘤细胞中，雄激素受体信号水平显著下降，与此同时，细胞在转录组水平上发生显著的分化调整，下调腔状细胞luminal的特质，朝基底状/间充质状/神经内分泌状态 (EMT, NE) 持续分化。此现象在CHD1-缺失的耐药性肿瘤里提取的RNA，蛋白，免疫荧光和免疫组化上均得到验证。

为了找到决定细胞谱系命运变化和抗药性的关键转录因子，研究者把注意力集中在了转录因子上，尤其是那些决定细胞分化的谱系特异性转录因子。通过对RNA-seq和ATAC-seq的结果进行整合分析，研究者鉴定出了在CHD1-缺失的耐药性肿瘤细胞中高表达以及高度激活的22个转录因子。随后通过体外快速的CRISPR-Cas9遗传筛选，最终鉴定出了4个关键的转录因子NR3C1 (GR, 糖皮质激素受体) ，BRN2, NR2F1和TBX2。在CHD1-缺失的耐药性肿瘤细胞中敲除其中任何一个转录因子均可以使得肿瘤细胞重新恢复对二代雄激素抑制剂的敏感性。更为关键的是，敲除这四个因子本身并不影响野生型细胞的生长。因而四个耐药性影响因子的功能是特异性促进耐药性的。研究者通过BET抑制剂选择性抑制GR的表达可以有效的抑制已经耐药的肿瘤生长，这为后续的药物开发和联合用药提供了崭新的思路。

图3: GR抑制剂和恩杂鲁胺的联合用药显著扭转了肿瘤抗药性并抑制了抗药肿瘤的生长。

更为有趣的是，研究者制作并且研究了一大批独立产生的，CHD1基因缺失的抗药性肿瘤细胞系，发现这些肿瘤在建立抗性的过程中随机选了一到两个抗性转录因子作为最主要的抗性生存因子。这一发现第一次对抗药性前列腺癌中大幅上升的肿瘤异质性提供了分子层面的解释：由于CHD1控制的染色质结构失控，不同的抗药性转录因子在不同的肿瘤细胞中获得了随机的激活和启动。在药物治疗的过程中由于药物的选择压力，高表达不同转录因子的肿瘤细胞最终存活，从而产生了大量的肿瘤异质性 （图）。这个发现在晚期去势抵抗性前列腺癌病人的基因组测序数据库（SU2C）中得到了进一步证实，在CHD1-低表达的病人群体中，均可观察到以上任意1-4个转录因子的单独或协同上调。研究者同时还观察到在一部分病人中，CHD1-低表达与4个转录因子的表达并没有负相关性，这进一步暗示着在更大规模的病人群体中，耐药性的肿瘤存在着更加复杂的异质性，新的耐药性机制亟待发现。

图4. CHD1缺失导致染色质结构调节失控，继而造成肿瘤异质性上升和抗性的产生。

最后，CHD1的缺失现象可以在15-20%的前列腺癌症病人中发现。作为一个染色质结构重塑的调控因子，它在维持染色体的结构和功能稳定性上起到至关重要的作用。它的功能缺失导致了染色质状态的可塑性增强，当肿瘤细胞遇上外界选择压力，比如二代雄激素受体抑制剂的时候，会加速进化过程，通过调整细胞谱系状态来应对外界压力，进而更快的获得耐药性。找到新的谱系依赖性的关键因子们，并且进行多方位联合“打靶”将会有效的帮助我们抗击肿瘤耐药性，进一步加强治疗的效果和病人预后。

[2] H. I. Scher et al., Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy. N Engl J Med. 2012.

[3] T. M. Beer et al., Enzalutamide in metastatic prostate cancer before chemotherapy. N Engl J Med. 2014.

[4] M. Hussain et al., Enzalutamide in Men with Nonmetastatic, Castration-Resistant Prostate Cancer. N Engl J Med. 2018. 

[5] M. R. Smith et al., Apalutamide Treatment and Metastasis-free Survival in Prostate Cancer. N Engl J Med. 2018.

[6] P. A. Watson, V. K. Arora, C. L. Sawyers, Emerging mechanisms of resistance to androgen receptor inhibitors in prostate cancer. Nat Rev Cancer. 2015.

[7] C. Fellmann et al., An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Rep. 2013.

[8] A. Gaspar-Maia et al., Chd1 regulates open chromatin and pluripotency of embryonic stem cells. Nature. 2009.

[9] Zeda Zhang et al., CHD1-Loss confers AR targeted therapy resistance via promoting cancer heterogeneity and lineage plasticity. Cancer Cell. 2020